大豆在暗誘導下光周期及衰老相關(guān)基因的差異表達研究

　　《大豆在暗誘導下光周期及衰老相關(guān)基因的差異表達研究》講述了：黑龍江省是我國大豆主要生產(chǎn)基地，加入世貿(mào)組織后，大豆面臨嚴重的進口壓力。主要原因是我國大豆單產(chǎn)低，競爭力不強。大豆屬于短日照植物，其生長發(fā)育對光周期反應非常敏感，這一特性嚴重阻礙大豆品種的適應性，是制約大豆單產(chǎn)提高和穩(wěn)產(chǎn)的關(guān)鍵因素。暗處理相當于短日照，可以縮短大豆的開花和成熟期，其表型之一是加速葉片的衰老。葉細胞的結(jié)構(gòu)、代謝和基因表達都協(xié)調(diào)的發(fā)生變化，細胞器官的組分被依次有序的分解。代謝變化包括合成代謝活性的減弱，如光合作用和蛋白質(zhì)的合成，以及分解代謝的加速，如核酸降解和蛋白水解。這些對維持植物生長和生殖是非常必要的，基因轉(zhuǎn)錄物豐度的巨大變化揭示了從有光合活性的葉片到作為流動營養(yǎng)物來源的衰老器官來維持發(fā)育的轉(zhuǎn)變情況。為了打破大豆種植區(qū)域的局限性，本研究在細胞分子水平上從基因差異表達的角度研究短日照光周期誘導開花和衰老過程中基因轉(zhuǎn)錄豐度的變化，克隆與大豆光周期反應及衰老有關(guān)的基因，從而探索大豆葉片感受日長變化誘導開花和衰老的復雜機制。雖然植物花器官的分化發(fā)生在頂端分生組織，在開花過程中的基因表達也必然在頂端分生組織中有所反映，然而植物感受光的器官是葉片，并利用長距離信號通過韌皮部傳導至頂端分生組織（SAM）影響生殖生長，在光周期控制開花過程中也必然牽涉葉片中很多基因的互作。由于黑暗的長度是開花時間的關(guān)鍵決定因素，在光周期控制開花過程中基因可能在夜間表達有差異，所以，以晝夜交替時的大豆的兩個樣本的葉片為研究目的對象，構(gòu)建了差異表達的cDNA消減文庫，發(fā)現(xiàn)與暗誘導相關(guān)的差異表達基因，揭示了有關(guān)參與機體暗適應下蛋白質(zhì)的上調(diào)表達的信息，為進一步分離暗處理產(chǎn)生差異表達基因奠定了基礎(chǔ)。通過轉(zhuǎn)化短日照煙草，進行光周期反應基因的功能驗證，分析該類基因在光周期反應中的作用。同時，研究外源激素的施加對光周期途徑相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因表達的影響；分析開花誘導中基因組織特性的表達情況。本研究的宗旨是通過基因的克隆和改造，試圖從根本上改變大豆對光的敏感性，為大豆高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)提高尋找新的突破口，從根本上扭轉(zhuǎn)我國大豆依賴于進口的被動局面。主要結(jié)果如下。1.本試驗首次應用抑制性消減雜交（SSH）技術(shù)以東農(nóng)u3大豆的短日照（8h光/16h暗）和長日照（16h光/8h暗）兩個樣本為研究目的對象，構(gòu)建了含有1738個克隆的差異表達的cI）NA消減文庫，對148個克隆進行測序，在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了76個與暗誘導相關(guān)的差異表達ESTs（上調(diào)至少3倍），根據(jù)Blastn和Blastx推測這些ESTs的功能包括參與轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導和細胞凋亡的調(diào)節(jié)類蛋白；參與大分子降解的酶類如蛋白和核酸的降解、參與細胞壁修飾的合成代謝、初級代謝以及次級代謝的酶類和解毒與防衛(wèi)的壓力反應的基因。揭示了有關(guān)參與機體暗適應下蛋白質(zhì)的上調(diào)表達的信息，為進一步分離短日處理產(chǎn)生差異表達基因奠定了基礎(chǔ)。2.為了研究GmRAV在大豆短日照信號轉(zhuǎn)導中的可能作用，我們利用cDNA末端快速擴增（RACE）技術(shù)從大豆中克隆了編碼GmRAv的cDNA序列。序列分析結(jié)果表明，GmRAV基因編碼351個氨基酸，含有AP2/ERF和B3結(jié)構(gòu)域，GenBank登陸號為DQ147914，其DNA序列與辣椒、水稻和擬南芥RAV基因高度同源。3.Real-time RT-PCR分析在短日照和長日照條件下大豆葉片中GmRAV基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的豐度變化，表明該基因的豐度在短日照（SD）時都要顯著高于在長日照（LD）條件下的豐度。4.分析GmRAV基因在不同組織中mRNA轉(zhuǎn)錄物的豐度變化表明，SD強烈誘導GmRAV基因在葉、根和莖中的表達。5.構(gòu)建了植物表達載體pBI121-GmRAV，用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草過量表達該基因，獲得卡那霉素抗性植株54株。PCR方法鑒定Tn轉(zhuǎn)基因株系，獲得18個轉(zhuǎn)基因的PCR陽性植株。通過Northern分析表明這4株轉(zhuǎn)基因煙草中的GmRAV基因都轉(zhuǎn)錄，表明它們都已成功轉(zhuǎn)入煙草中，并正常表達。6.GmRAV過量表達的煙草植株與對照相比無論在長日照和短日照下植株都明顯矮小，節(jié)間距短，節(jié)數(shù)少，并且在土壤中生長時葉片更深綠，葉片小，GmRAV過量表達對莖和葉的發(fā)育以及植株的生長有推遲抑制作用。轉(zhuǎn)大豆GmRAV基因的煙草植株無論在長日照和短日照條件下均表現(xiàn)出開花延遲的特征，并且光周期敏感性增強，非轉(zhuǎn)基因煙草在長日照比短日照條件下開花提前3天，而GmRAV過表達的煙草植株在長日照比短日照條件下開花卻提前13天。7.GmRAV是BR信號轉(zhuǎn)導途徑的抑制因子，GmRAV基因通過抑制BR信號而抑制植物細胞伸長從而抑制生長，導致轉(zhuǎn)基因植株矮化。8.GmRAV是GA生長信號轉(zhuǎn)導途徑中的促進因子，是ABA和黑暗促進衰老途徑中的促進因子。

　　趙琳（1980- ），女，黑龍江省鶴崗市人，博士，助理研究員。主要從事大豆生物技術(shù)研究，2007年至今工作于東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/大豆生物學省部共建教育部重點實驗室。在利用抑制性消減雜交技術(shù)尋找差異表達基因、基因克隆、生物信息學、植物組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因品種培育研究方面取得一定的成績。